2. lékařská fakulta

LAboratoř Molekulární PAtologie (LaMPa)

Laboratoř molekulární patologie se zabývá moderní diagnostikou a výzkumem v oboru dětských a dospělých nádorových onemocnění (lymfomy, sarkomy).

Seznam prováděných vyšetření u těchto typů onemocnění:

I. LYMFOMY

U pacientů s B a T NHL vyšetřujeme klonalitu onemocnění pomocí přestaveb genů pro imunoglobuliny (Ig) a T buněčné receptory (TCR) za využití polymerázové řetězové reakce (PCR) podle mezinárodního protokolu (European BIOMED-2 collaborative study) (lit: Leukemia 2003;17:2257-2317). U imunoglobulinových genů vyšetřujeme přeskupení těžkých (IgH), lehkých (IgL) a kappa (IgK) řetězců, v případě TCR řetězce delta (TCRD), gama (TCRG) a beta (TCRB). Na základě detekované klonální přestavby v primárním nádoru následně provádíme sledování minimální reziduální nemoci (MRN) v kostní dřeni a periferní krvi pomocí pacient specifických primerů a PCR v reálném čase (kvantitativní PCR – RQ-PCR).

U pacientů s MCL stanovujeme na molekulární úrovni přítomnost translokace t(11;14), jíž také využíváme ke kvalitativnímu sledování MRN.
- u pacientů s MCL dále provádíme kvantitativní detekci exprese cyklinu D1 (jako důsledku translokace t(11;14)) pomocí reverzně transkriptázové PCR v reálném čase (RQ-RT-PCR) a také pomocí kvantitativní detekce exprese cyklinu D1 sledujeme MRN. Dále vyšetřujeme hladiny exprese proliferačních markerů – Ki67, TPX2 a topoizomerázyIIα.

Mezi další vyšetřované „markery“ patří translokace t(14;18) – jak oblast MBR, 5´MBR tak mcr, přítomna přibližně u 80-90 % FL a přibližně u 30 % DLBCL. U všech těchto pacientů sledujeme MRN pomocí RQ-PCR.

U pacientů s MZL-MALT lymfomem vyšetřujeme přítomnost translokace t(11;18) – fúze genů MALT/API, kdy v rámci detekce MRN využíváme RQ-RT-PCR.

U ALCL stanovujeme aktivovaný onkogen ALK fúzí s různými partnery: ALK/NPM, ALK/TPM3, ALK/TGF, ALK/ATIC, ALK/CTLC. U všech těchto pacientů sledujeme MRN kvalitativní PCR a v případě fúzního genu ALK/NPM sledujeme MRN pomocí RQ-RT-PCR. Dále u těchto pacientů sledujeme pomocí RQ-RT-PCR hladinu exprese molekuly CD30.

II. SARKOMY

U SynSa vyšetřujeme přítomnost fúzního genu SYT/SSX (SYT/SSX1, SYT/SSX2) jako výsledek t(X;18). Dále vyšetřujeme (RQ-RT-PCR) hladiny exprese genů Bcl2, ERBB2, Ki67 a cyklinu D1.

U RMS vyšetřujeme přítomnost translokace t(1;13) a t(2;13) – fúzní geny PAX/FKHR (PAX3/FKHR, PAX7/FKHR), dále expresi α a γ podjednotky acetylcholinového receptoru a expresi genu pro myoD1 a myogenin. V případě fúzních genů PAX/FKHR, genu pro MyoD1 a myogenin využíváme RQ-RT-PCR pro detekci MRN.

U RMS dále vyšetřujeme pomocí analýzy mikrosatelitních lokusů ztrátu heterozygozity (LOH) v oblastech krátkého ramene 11. chromozomu (výskyt možných nádorově supresorových genů), v oblasti 9p - lokalizace genů pro inhibitory cyklin dependentních kináz p15 a p16 a v oblasti mutátorových genů hPMS1, hMSH2 a hMLH1.

U I-FS a MN vyšetřujeme přítomnost fúzního genu ETV6/NTRK (TEL/TRK).

U ASPS vyšetřujeme přítomnost fúzního genu ASPL/TFE3.

U LS vyšetřujeme fúzní geny TLS/CHOP a EWS/CHOP.

Také vyšetřujeme pomocí RQ-RT-PCR v reálném čase expresi katalytické podjednotky telomerázy hTERT.

Materiál

Nejvhodnější materiál pro izolaci nukleových kyselin z primárních nádorů je zmražená tkáň, tzn. zaslána nativní, příp. ve fyziologickém roztoku. V případě konzultačních vyšetření preferujeme fixaci materiálu v alkoholu (40-70%) namísto fixace ve formolu. Jsme však schopni v omezených podmínkách (v závislosti na použitém formolu, délce fixace apod., fixace ve formolu štěpí nukleové kyseliny) izolovat nukleové kyseliny i z parafínových bloků.

Pro detekci reziduální nemoci využíváme odběry punktátů kostní dřeně a/nebo periferní krve odebrané do protisrážlivého prostředku, nejčastěji EDTA. Antikoagulační médium heparin je nevhodný neboť může blokovat následné PCR reakce.
 

 
Kvantitativní PCR cyclery:
 

 
Příklady výsledků:
A-sekvenování a ověřování translokace t(11;14)
B-sledování minimální reziduální nemoci pomocí fúzního genu NPM/ALK a exprese molekuly CD30 u pacienta s anaplastickým velkobuněčným lymfomem
 

Z publikační aktivity LaMPa:

Publikace v zahraničních časopisech

Kalinova M., Krskova L., Brizova H., Kabickova E., Kepak T., Kodet R.: Quantitative PCR detection of NPM/ALK fusion gene and CD30 gene expression in patients with anaplastic large cell lymphoma – residual disease monitoring and a correlation with the disease status - Leukemia Research, 2007 v tisku
 
Krsková, L., Sumerauer, D., Stejskalová, E., Kodet, R.: A novel variant of SYT-SSX1 fusion gene in a case of spindle cell synovial sarcoma, Diagnostic Molecular Pathology – 2007 po revizi zasláno do tisku
 
Sumerauer D., Vicha A., Zuntova A., Stejskalova E., Krskova L., Kabickova E., Kodet R., Eckschlager T.: Teratoma in an adolescent with malignant transformation into embryonal rhabdomyosarcoma: case report. J Pediatr Hematol Oncol. 2006 Oct;28(10):688-92.
 
Krsková L., Mrhalová M., Sumerauer D., Kodet R.: Rhabdomyosarcoma: molecular diagnostics of patients classified by morphology and immunohistochemistry with emphasis on bone marrow and purged peripheral blood progenitor cells involvement; Virchows Arch. 2006 Apr;448(4):449-58 (IF 2,227)
 
Jindřichová Š., Kodet R., Krsková L., Vlček P., Bendlová B. The newly detected mutations in the RET proto-oncogene in exon 16 as a cause of sporadic medullary thyroid carcinoma. J Mol Med. 2003 Dec;81(12):819-23. Epub 2003 Nov 15. (IF 4,256)
 
Soukup J., Krsková L., Hilská I., Kodet R. Ethanol fixation of lymphoma samples as an alternative approach for preservation of the nucleic acids. Neoplasma. 2003;50(4):300-4. (IF 0,822)
 
Kodet R., Mrhalová M., Krsková L., Soukup J., Campr V., Neškudla T., Szepe P., Plank L.: Mantle cell lymphoma: improved diagnostics using a combined approach of immunohistochemistry and identification of t(11;14)(q13;q32) by polymerase chain reaction and fluorescence in situ hybridization. Virchows Arch. 2003 Jun;442(6):538-47. Epub 2003 May 01. (IF 2,227)
 
Mrhalová M., Kodet R., Kalinová M., Hilská I.: Relative quantification of ERBB2 mRNA in invasive duct carcinoma of the breast: correlation with the ERBB-2 protein expression and the ERBB2 gene copy number. Pathology - Research and Practice 2003, 199: 453-461
 

Publikace v domácích časopisech

Krsková L., Hilská I., Kopecká P., Soukup J., Kodet R.: Molekulární diagnostika maligních lymfomů řady B: detekce klonality a stručný přehled problematiky s vlastními výsledky, Čas. lék. českých 3/ 2004; str. 191-197
 
Kodet R., Mrhalová M., Krsková L., Manďáková P., Kalinová M.: Život patologa mezi molekulami - výstroj a výzbroj pro přežití, 2004 Klinická onkologie 17 (1): 3-8
 
Mrhalová M., Krsková L., Kalinová M., Soukup J., Kodet R.: Folikulární lymfomy: molekulární diagnostika t(14;18)(q32;q21) - fluorescenční in situ hybridizace, kvalitativní a kvantitativní PCR. Česko-slovenská patologie 2003, 39 (3): 130-137
 
Soukup J., Krsková L., Campr V.: New aspects of MALT lymphomas of the stomach. Česko-slovenská patologie. 2003 Jul;39(3):120-5.
 
Kodet R., Mrhalová M., Krsková L., Stejskalová E.: Anaplastický velkobuněčný lymfom: přehled problematiky. Československá patologie 2003, 39 (3): 102-114
 
Soukup J., Krsková L., Mrhalová M., Kodet R., Campr V., Kubáčková K., Trněný M.: Velkobuněčné difúzní B-lymfomy: heterogenní původ a prognóza z hlediska současné diagnostiky. Časopis lékařů českých 2003, 142 (7): 417-422
 

Abstrakta v zahraničních časopisech

Markéta Kalinová, Kateřina Mužíková, Lenka Krsková, Irena Hilská, Alena Augustiňáková, Edita Kabíčková, Tomáš Kepák, Roman Kodet: Real-time quantitative PCR detection of fusion gene NPM/ALK, cytokine receptor CD30 and T-cell receptor rearrangement in patients with ALCL: monitoring residual disease and correlation with disease status; XXVI Congress of the IAP, 16.9.-21.9.2006, Modern Pathology 19 (3) 2006, p.116
 
Linda Čapková, Markéta Kalinová, Lenka Krsková, Daniela Kodetová, František Petřík, Martin Trefný, Jaromír Musil: Detection of molecular changes in bronchial mucosa of heavy smokers in correlation with findings of autofluorescence bronchoscopy; XXVI Congress of the IAP, 16.9.-21.9.2006, Modern Pathology 19 (3) 2006, p.164
 
Lenka Krsková, Irena Hilská, Alena Augustiňáková, Markéta Kalinová, Marcela Mrhalová, Marie Neradová, Roman Kodet: Expression of ERBB2 and BCL-2 in synovial darcoma; XXVI Congress of the IAP, 16.9.-21.9.2006, Modern Pathology 19 (3) 2006, p.181
 
Kalinova M., Krskova L., Hilska I., Kopecka P., Kodet R.: Real-time quantitative PCR detection of fusion gene ALK/NPM in patients with ALCL: residual disease monitoring and a correlation with the disease status - Virchows Archiv 2005, 2, 264
 
Soukup J, Campr V, Manďáková P, Krsková L, Kalinová M, Mrhalová M, Kodet R (2004) Malignant lymphoma as a part of multiple primary tumors. XII. Meeting of the European Association for Haemathopathology, 26.9.-1.10.2004
 
Mrhalová M, Kalinová M, Krsková L, Soukup J, Kodet R (2003) Monitoring of patients with  ollicular lymphoma carrying t(14;18)(q32;q21) by real time quantitative PCR. 19th European Congress of Pathology, 6-11.9.2003 Ljubljana Slovenia. Virchows Archiv 443 (3): 405, P-349
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Campr V, Szepe P, Plank L, Kubáčková K (2003) Mantle cell lymphoma (MCL): Ki-67 antigen and chromosome 12 ploidy in an estimate of the tumor progression. 19th European Congress of Pathology, 6-11.9.2003 Ljubljana Slovenia. Virchows Archiv 443 (3): 407, P-353
 
Mrhalová M, Kalinová M, Kodet R (2002) Quantitative RT-PCR as a tool solving discrepant results between ERBB2 gene copy numbers and expression of the ERBB-2 protein: An improvement of Herceptin therapy indication in breast carcinomas. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.-10.10.2002 Amsterdam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 3, O.01.216
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Kabíčková E (2002) Burkitt´s lymphoma (BL): fluorescence in situ hybridization (FISH) on interphasic nuclei as a tool to reveal specific translocations, PCR detection of clonality and bone marrow (BM) involvement. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5-10.10.2002 Amsterodam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 91, P.03.201
 
Soukup J, Krsková L, Mrhalová M, Kodet R, Campr V, Kubáčková M, Trněný M (2002) Diffuse large B cell lymphomas (DLBCL): analysis of the heterogeneous group by means of immunohistochemistry, PCR and FISH. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.-10.10.2002 Amsterdam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 15, O.03.366
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Szépe P (2001) Mantle cell lymphoma (MLC): A combined immunohistochemical (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH) and PCR study. 18th European Congress of Pathology, 8.-13.9.2001 Berlin Germany. Virchows Archiv 439 (3): 417, P-459
 
 

KONTAKT:

V Praze, 5. února 2007