2. lékařská fakulta

Laboratoř in situ hybridizace

Laboratoř in situ hybridizace vznikla na pracovišti Ústavu patologie a molekulární medicíny 2. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice v Motole v roce 1998.

Laboratoř se zabývá problematikou nádorových onemocnění dětí a dospělých. Stěžejní vyšetřovací metodou je metoda fluorescenční in situ hybridizace na interfázických jádrech (I-FISH) a specializovaná imunohistochemická vyšetření navazující na rutinní laboratoř imunohistochemie. Laboratoř disponuje moderním přístrojovým vybavením. Pro hodnocení I-FISH se používají dva fluorescenční mikroskopy – Provis AX70 (Olympus) a Axioplan 2 (Carl Zeiss). Mikroskop Axioplan 2 je vybaven modulem ApoTome (Carl Zeiss).

Činnost Laboratoře in situ hybridizace je hrazena z prostředků výzkumných záměrů a grantových projektů.

Vyšetřovaný materiál

Hlavním typem vyšetřovaného materiálu jsou histologické řezy z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání. Vyšetření histologického řezu umožňuje morfologickou orientaci ve tkáni. Na základě morfologické znalosti tkáně (výhoda začlenění laboratoře I-FISH na pracovišti patologie) lze odlišit nádorovou populaci od populace nenádorové. Vyšetření histologického řezu také umožňuje korelaci výsledku I-FISH s výsledky imunohistochemickými (zjištění exprese proteinů in situ v tkáni). V neposlední řadě lze pro I-FISH použít archivní parafinové bloky. Nevýhodou vyšetření histologických řezů je odkrojení části jader při přípravě histologického řezu – krájení na mikrotomu. Vyšetření není vhodné pro sledování minimální residuální choroby.

Dalším typem vyšetřovaného materiálu jsou otiskové preparáty z nativní tkáně. Výhodou vyšetření I-FISH na otiskovém preparátu je zachování celého objemu jádra. Nevýhodou je ztráta morfologie vyšetřované tkáně a časově omezená trvanlivost preparátu. Obdobným způsobem jako otiskové preparáty lze vyšetřit také cytospinové preparáty buněčných tekutin.

Prováděná vyšetření

V laboratoři používáme přímo značené sondy (Vysis / Abbott). Tyto sondy lze použít na jádra v interfázi. Ve srovnání s např. leukemickými buňkami (pomocí FISH se vyšetřují hlavně na metafázických chromosomech), jsou solidní nádory obtížně kultivovatelné. Kvalita získaných chromosomů není optimální a v průběhu dlouhodobé kultivace se může měnit zastoupení buněk, které nemusí v konečné fázi dobře reprezentovat složení nádoru. Často kultury přerostou buňkami nenádorovými. Z tohoto důvodu se v naší laboratoři pracuje s jádry v interfázi.

Pomocí lokus specifických sond vyšetřujeme amplifikace genů, delece chromosomálních oblastí, chromosomální translokace a zlomy. Pomocí sond centromerických lze zjistit počet chromosomů. Hodnotíme buď počet signálů (např. amplifikace genů, počet chromosomů), nebo jejich uspořádání v interfázických jádrech (např. translokace nebo chromosomální zlomy).

V tabulce je uveden přehled vyšetření prováděných v naší laboratoři. Některá z níže uvedených vyšetření se používají pro diagnózu onemocnění - chromosomální změna je pro onemocnění charakteristická (např. lymfom z buněk pláště a t(11;14)).

V některých případech pomůže vyšetření odlišit dvě formy nádoru (např. rabdomyosarkom - alveolární se zlomy v oblasti FKHR, embryonální bez zlomu).

Stanovení amplifikace genu ERBB2 u nemocných s karcinomy mléčné žlázy slouží, společně se stanovením exprese proteinu ERBB-2, pro indikaci k terapii humanizovanou protilátkou Herceptinem.

V jiných případech se používá stanovení zlomu určité chromosomální oblasti jako „screeningové“ pro následné vyšetření metodami molekulárními (např. stanovení zlomu ALK genu u velkobuněčných anaplastických lymfomů).

V některých případech má vyšetření chromosomálních změn přínos prognostický. Metodu I-FISH lze s výhodou také použít pokud není kvalita formolem fixované tkáně dostatečná pro izlolace nukleových kyselin pro metody molekulární.
 

Pro ilustraci uvádíme ukázky výsledku vyšetření metodou I-FISH na histologických řezech z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání.
 

Příklady výsledků I-FISH na histologických řezech z formolem fixovaných a do parafinu zalitých tkání: A) lymfom z buněk pláště - t(11;14) - dva fúzní zeleno-žluto-červené signály v jádrech nádorových buněk; B) velkobuněčný anaplastický lymfom - zlom 2p23 - oddálené zelené a červené signály v jádrech nádorových buněk; C) karcinom mléčné žlázy - amplifikace genu ERBB2 (červené signály), 2-3 zelené signály (centromera chromosomu 17)

Z publikační činnosti Laboratoře in situ hybridizace:

Publikace zahraniční

Mrhalová M, Kodet R (2006) A modified approach for I-FISH evaluation of ERBB2 (HER-2) gene copy numbers in breast carcinomas: comparison with HER-2/CEP17 ratio system. J Cancer Res Clin Oncol. Dec 13; [Epub ahead of print]
 
Stejskalová E, Jarošová M, Kabíčková E, Šmelhaus V, Mrhalová M, Kodet R (2006) Primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma with a der(14)t(8;14)(q24;q32) and a translocation of MYC to the derivative chromosome 14 with a deleted IGH locus. Cancer Genetics and Cytogenetics Oct 15; 170(2): 158-162
 
Krsková L, Mrhalová M, Sumerauer D, Kodet R (2006) Rhabdomyosarcoma: molecular diagnostics of patients classified by morphology and immunohistochemistry with emphasis on bone marrow and purged peripheral blood progenitor cells involvement. Virchows Archiv Apr, 448(4): 449-458
 
Mrhalová M, Plzák J, Betka J, Kodet R (2005) Epidermal growth factor receptor – its expression and copy numbers of EGFR gene in patients with head and neck squamous cell carcinomas. Neoplasma 52(4): 338-343
 
Mrhalová M, Kodet R (2003) Paget’s disease of the nipple: a copy number of the genes ERBB2 and CCND1 versus expression of the proteins ERBB-2 and cyclin D1. Neoplasma 50(6): 396-402
 
Mrhalová M, Kodet R, Kalinová M, Hilská I (2003) Relative quantification of ERBB2 mRNA in invasive duct carcinoma of the breast: correlation with the ERBB-2 protein expression and the ERBB2 gene copy number. Pathology - Research and Practice 199: 453-461
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Campr V, Neškudla T, Szépe P, Plank L (2003) Mantle cell lymphoma: improved diagnostics using a combined approach of immunohistochemistry and identification of t(11;14)(q13;q32) by polymerase chain reaction and fluorescence in situ hybridization. Virchows Archiv 442: 538-547
 

Abstrakta v mezinárodních časopisech

Krsková L, Hilská I, Augustiňáková A, Kalinová M, Mrhalová M, Neradová M, Kodet R (2006) Expression of ERBB2 and BCL-2 in synovial darcoma. XXVI Congress of the International Academy of Pathology, 16-21.9 2006 Montreal Kanada. Modern Pathology 19 (3), p.181
 
Mrhalová M, Plzák J, Betka J, Kodet R (2005) Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC): Epidermal growth factor receptor (EGFR) protein expression and EGFR gene copy numbers. 20th European Congress of Pathology, 3-8.9.2005 Paris France. Virchows Archiv 447 (2): 411, P 566; Sdělení bylo vyhodnoceno jako nejlepší poster kongresu.
 
Mrhalová M, Neradová M, Kodet R (2005) A modified approach for evaluation of ERBB2 (HER2) gene copy number in moderately amplified invasive duct carcinomas (IDC) of the breast. 20th European Congress of Pathology, 3-8.9.2005 Paris France. Virchows Archiv 447 (2): 363, P 413
 
Campr V, Mrhalová M, Neradová M, Pytlík R (2005) Immunohistochemical detection of STAT1 and TRAF1 in mediastinal large B-cell lymphoma. 20th European Congress of Pathology, 3-8.9.2005 Paris France. Virchows Archiv 447 (2): 265, P 113
 
Soukup J, Campr V, Manďáková P, Krsková L, Kalinová M, Mrhalová M, Kodet R (2004) Malignant lymphoma as a part of multiple primary tumors. XII. Meeting of the European Association for Haemathopathology, 26.9.-1.10.2004
 
Mrhalová M, Kalinová M, Krsková L, Soukup J, Kodet R (2003) Monitoring of patients with follicular lymphoma carrying t(14;18)(q32;q21) by real time quantitative PCR. 19th European Congress of Pathology, 6-11.9.2003 Ljubljana Slovenia. Virchows Archiv 443 (3): 405, P-349
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Campr V, Szepe P, Plank L, Kubáčková K (2003) Mantle cell lymphoma (MCL): Ki-67 antigen and chromosome 12 ploidy in an estimate of the tumor progression. 19th European Congress of Pathology, 6-11.9.2003 Ljubljana Slovenia. Virchows Archiv 443 (3): 407, P-353
 
Mrhalová M, Kalinová M, Kodet R (2002) Quantitative RT-PCR as a tool solving discrepant results between ERBB2 gene copy numbers and expression of the ERBB-2 protein: An improvement of Herceptin therapy indication in breast carcinomas. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.-10.10.2002 Amsterdam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 3, O.01.216
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Kabíčková E (2002) Burkitt´s lymphoma (BL): fluorescence in situ hybridization (FISH) on interphasic nuclei as a tool to reveal specific translocations, PCR detection of clonality and bone marrow (BM) involvement. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5-10.10.2002 Amsterodam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 91, P.03.201
 
Soukup J, Krsková L, Mrhalová M, Kodet R, Campr V, Kubáčková M, Trněný M (2002) Diffuse large B cell lymphomas (DLBCL): analysis of the heterogeneous group by means of immunohistochemistry, PCR and FISH. XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology, 5.-10.10.2002 Amsterdam Netherlands. Histopathology 41 (suppl 1): 15, O.03.366
 
Mrhalová M, Kodet R, Neradová M (2001) Paget’s disease of the breast – copy numbers of c-erbB-2, CCND1 and TP53 genes (FISH), expression of their protein products (IHC). 18th European Congress of Pathology, 8.-13.9.2001 Berlin Germany. Virchows Archiv 439 (3): 445-446, P-549
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Soukup J, Szépe P (2001) Mantle cell lymphoma (MLC): A combined immunohistochemical (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH) and PCR study. 18th European Congress of Pathology, 8.-13.9.2001 Berlin Germany. Virchows Archiv 439 (3): 417, P-459
 
Kodet R, Mrhalová M, Soukup J, Michal M, Dvořák K, Plank L (2000) Anaplastic large cell lymphoma (ALCL): Immunohistochemical analysis with the assessment of the translocation of the ALK gene. XXIII International Congress of the International Academy of Pathology, 15.-20.10.2000 Nagoya Japan. Pathology International 50 (suppl): A143, P-17-103
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (2000) Amplification of c-erbB-2 and CCND1 genes in breast carcinomas (FISH) compared with expression of c-erbB-2 and cyclin D1 proteins (IHC). XXIII International Congress of the International Academy of Pathology, 15.-20.10.2000 Nagoya Japan. Pathology International 50 (suppl): A39, P-18-67
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (1999) C-erbB-2 oncogene expression detected by FISH in correlation with membrane expression of c-erbB2 oncoprotein in patients with breast carcinomas. 17th European Congress of Pathology, 18.-23.9.1999 Barcelona Spain. Virchows Archiv 435 (3): 198, P-023
 

Publikace domácí

Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Manďáková P, Kalinová M (2004) Život patologa mezi molekulami – výstroj a výzbroj pro přežití. Klinická onkologie 17 (1): 3-8
 
Mrhalová M, Krsková L, Kalinová M, Soukup J, Kodet R (2003) Folikulární lymfomy: molekulární diagnostika t(14;18)(q32;q21) - fluorescenční in situ hybridizace, kvalitativní a kvantitativní PCR. Česko-slovenská patologie 39 (3): 130-137
 
Soukup J, Krsková L, Mrhalová M, Kodet R, Campr V, Kubáčková K, Trněný M (2003) Velkobuněčné difúzní Blymfomy: heterogenní původ a prognóza z hlediska současné diagnostiky. Časopis lékařů českých 142 (7): 417-422
 
Kodet R, Mrhalová M, Krsková L, Stejskalová E (2003) Anaplastický velkobuněčný lymfom: přehled problematiky. Česko-slovenská patologie 39 (3): 102-114
 
Dvořáčková J, Uvírová M, Kerlínová V, Kodet R, Mrhalová M (2002) Imunohistochemický (IHC) průkaz HER2 proteinu a jeho hodnocení u nemocných s karcinomy mléčné žlázy: Srovnávací studie dvou pracovních postupů (HercepTest DAKO versus běžný IHC postup s polyklonální protilátkou DAKO) a výsledků dvou pracovišť. Česko-slovenská patologie 38 (suppl S1): 20-26
 
Mrhalová M, Kodet R (2002) Indikace k léčbě nemocných s invazivními duktálními karcinomy mléčné žlázy Herceptinem z pohledu laboratorní diagnostiky - vyšetření ERBB-2 proteinu a stanovení počtu kopií ERBB2 genu. Přehled problematiky. Česko-slovenská patologie 38 (suppl S1): 4-14
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (2002) Invazivní duktální karcinomy mléčné žlázy: vyšetření počtu kopií genu CCND1 a počtu chromozómů 11 metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) v porovnání s expresí proteinu cyklín D1 a receptoru pro estrogen (ERa) detegovanou imunohistochemicky (IHC). Časopis lékařů českých 141 (22): 708-714
 
Mrhalová M, Kodet R, Strnad P (2001) Korelace exprese c-erbB-2 genu (detekce metodou FISH) s membránovou expresí erbB-2 proteinu (detekce metodou IHC) u pacientek s karcinomy mléčné žlázy. Časopis lékařů českých 140 (18): 553-559
 
 

KONTAKT:

RNDr. Marcela Mrhalová, Ph.D.
tel: 224435634 (sekretariát ústavu: 224435600); e-mail:
 
Laboratoř in situ hybridizace
Ústav patologie a molekulární medicíny
UK 2. LF a FN v Motole
V Úvalu 84; 150 06 Praha 5 – Motol
 

V Praze, 28. ledna 2007