Changes in extracellular space size and geometry in APP23 transgenic mice: A model of Alzheimer-s disease.

Syková E., Voříšek I., Antonová T., Mazel T., Meyer Luehmann M., Jucker M., Hájek M., Or M., Bureš J.:
Changes in extracellular space size and geometry in APP23 transgenic mice: A model of Alzheimer-s disease.
PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) 102(2):479–484, 2005.

 
Extrasynaptický přenos v CNS, jehož mechanismem je difuze neuroaktivních látek extracelulárním prostorem, je dnes pokládán za nedílnou součást přenosu signálů v CNS. Uplatňuje se významě u celé řady funkcí, včetně paměti, učení, stresu, spánku, deprese atp. Tento přenos, respective změny difuzních parametrů nervové tkáně, jsou významě narušeny během celé řady neurodegenerativních onemocnění, včetně Alzheimerovy choroby a mohou být i příčinou symptomů těchto onemocnění. Ke studiu difuzních změn CNS jsme využili model Alzhaimerovy choroby u dobře popsaného kmene transgenních APP23 myší, u nich již v časném dospívání dochází k abnormální deposici amyloidu a k projevům demence.
Pomocí náročné invazivní elektrofyziologické metody využívající iontově selektivní mikroelektrody, tzv. iontoforetické metody, která dovojuje změřit absolutní hodnoty difúzních parametrů tkáně v reálném čase, jsme ukázali, že difúzní parametry se mění u normálně stárnoucí populace zcela jinak než u APP23 myší. Změny, které jsme prokázali touto invazivní metodou, jsem korelovali a potvrdili s neinvazivní metodou difuzně vážené magnetické resonance. Výsledky ukázaly, že difuzně vážená MR může být cennou diagnostickou metodou i u tohoto onemocnění. Prokázali jsem, že čím větší byly deposice amyloidu, tím větší byly změny v difuzních parametrech (ve velikosti mezibuněčných štěrbin a difusibilitě) a tím více bylo narušeno vytváření paměťových stop. Tyto výsledky mohou být využity jak pro diagnostické účely, tak při vývoji nových léčebných postupů.
 
Jak dlouho již probíhá výzkum extrasynaptického přenosu? Můžete zmínit některé důležité mezníky? Jak dlouho se výzkumem extrasynaptického přenosu zabýváte vy?
Extrasynaptický neboli tzv. objemový přenos, někdy též nazývaný nesynaptický nebo bezdrátový přenos, vychází z koncepce extracelulárního prostoru (ECP) jako mikroprostředí nervových buněk a z koncepce, že ECP je důležitý komunikační kanál. Tato skutečnost byla rozpoznána na začátku 70. let, ale teprve v 80. letech byl objeven přenos, který nemá přímý morfologický podklad, tj. spojení vlákny a synapsemi. Jeho podkladem je difuze látek v ECP (skrze jeho objem) a umístění receptorů mimo synapse, na membránách nejen neuronů, ale i gliových buněk. Tyto vysokoafinitní receptory mají svoji funkci např. u katecholaminergního, dopaminergního, ale i u glutamatergního přenosu. Vzhledem k existenci objemového přenosu je možné dnes např. úspěšně léčit pacienty s Parkinsonovou chorobou implantací dopaminergních buněk, které se nemusí v mozku zapojit do synaptických okruhů. Mechanizmem toho přenosu je difuze látek v ECP a proto studium tzv. difuzních parametrů mozku nám poskytuje údaje o funkci a změnách tohoto přenosu během fyziologických a patologických stavů. K rozvoji a získání těchto poznatků došlo zvláště v posledních 25 letech a to zvláště na pracovišti v New Yorku (Ch. Nicholson), ve Švédsku (K. Fuxe) a v Praze v mé laboratoři.
 

V článku uvádíte, že vyšetření tzv. iontoforetickou metodou je náročné. Můžete prosím popsat, jak váš experiment dlouho trval a kolik lidí se do něj zapojilo?
Jedinou z metod, která dovoluje in vivo měřit absolutní hodnoty všech tří difuzních parametrů je tzv. iontoforetická metoda v reálném čase, která využívá měření difúze zvolené látky pomocí iontově selektivních mikroelektrod. Tato metoda přepokládá zvládnutí výroby iontově selektivní mikroelektrody, dvoukanálové kapiláry naplněné pod mikroskopickou kontrolou tekutým iontoměničem, a její slepení po kalibraci s jinou kapilárou naplněnou roztokem látky, kterou budem konstatními elektrickými pulsy uvolňovat do mezibuněčného prostoru příslušné mozkové struktury např. v hipokampu. Abychom mohli z modifikovaných difuzních rovnic se třemi neznámými vypočítat tři hodnoty difuzních parametrů (objem ECP, difuzní koeficient v CNS a nespecifický uptake) potřebujeme mít všechny 3 mikroelektrody ve stejné hloubce a musíme znát vzdálenosti mezi jejich hroty. Jakákoliv změna fyziologického stavu zvířete vede k dramatickým změnám těchto parametrů a je tedy třeba zajistit jeho optimální stav.
Tato metoda není jedinou metodou a není ji možné použít v klinických studiích či k diagnostice. Proto se používá difuzně vážená magnetická resonance (DW-MRI). Ta má ovšem velmi omezené možnosti, stanoví pouze difuzní koeficient vody. Naše práce využívá i srovnání obou těchto metod, což je možné pravděpodobně pouze na našem pracovišti. Spojením obou metod jsme přispěli k porozumění výsledků získaných o extrasynaptickém přenosu metodou DW-MRI. Na experimentech se podíleli všichni spoluautoři práce, jedna skupina měřila iontově selektivními elektrodami, druhá pomocí MR a třetí prováděla behaviorální testování. Naši zahraniční spolupracovníci nám pouze poskytli příslušný kmen APP23 myší (Novartis) a vyhodnotili množství amyloidových plaků.
 
Zmínila jste možnost využití této metody při diagnostice Alzheimerovy nemoci. Probíhají podobné projekty i u jiných chorob?
Takové projekty probíhají u celé řady chorob. My sami jsem publikovali měření, opět pomocí obou metod, např. u ischemických stavů mozku, chronické bolesti na míšní úrovni, na modelu Parkinsonovy choroby, na modelu rostroušené sklerozy, u hydrocefalu, po poranění mozku a míchy, během epilepsie a v mozkových nádorech zvl. v gliomech. Podařilo se nám navrhnout přímé užití pro předoperační diagnostiku malignity nádoru, čím více je nádor maligní tím větší jsou změny difuzních parametrů. Na této problematice jsme příkladně spolupracovali s patology a neurochirurgy v Motolské nemocnici.
 
Můžete prozradit, zda se studiem Alzheimerovy nemoci budete zabývat i nadále? Naznačíte vaše další kroky? Budete pokračovat v tomto projektu nebo se zaměříte i na jiná onemocnění?
V současné době se zabýváme studiem difuzních parametrů pomocí DW-MRI a pomocí MR spektroskopie u pacientů s epilepsií, pokračují studie u pacientů a zvířat s implantovanými lidskými mozkovými nádory. Naše další kroky zahrnují i užití superparamagnetických nanočástic železa pro značení nádorových a implantovaných buněk a jejich in vivo zobrazování pomocí MR.
 

Pro Alzheimerovu nemoc je typický pomalý začátek. Bylo by pomocí difúzně váženého MR vyšetření možno stanovit správnou diagnózu významně dříve?
To je přesně náš plán, máme naplánovanou studii pro možnou diagnostiku počínající fáze Alzheimerovy choroby. Pokud bychom prokázali změny difuzních parametrů před zřetelnou klinickou manifestací choroby, pomohlo by to v diferenciální diagnostice a mohla by možná být i dříve nasazena vhodná léčba.
 
Jak těsná je korelace mezi stupněm depozice amyloidu a stupněm závažnosti demence?
To je v lidské patologii velmi sporné. U starých lidí často najdeme v pitevním protokolu obrovské amyloidové plaky a přesto tito lidé netrpěli Alzheimerovou chorobou. Na našem modelu u myší korelace byla. Není to však pouze korelace s plaky, ale i s deposicí množství extracelulárnního amyloidu v ECS, která u lidí běžně hodnocena není.
 
V klinické praxi se dnes často diagnóza Alzheimerovy nemoci ověřuje kvantitativním stanovením tau-proteinu a beta-amyloidu v mozkomíšním moku. Můžete k tomu prosím sdělit váš komentář? Jsou tyto laboratorní metody dostatečně specifické? Nesrovávali jste ve vašem experimentu výsledky vyšetření likvoru s vašimi nálezy?
To jsou jistě cenné metody, ale absolutní vypovídající hodnotu nemají. Je totiž např. důležité, které části mozku jsou nejvíce postiženy. My jsme v našich pokusech tuto korelaci neměřili.
 
Zmínila jste možný přínos vašich výsledků i při vývoji nových léčebných postupů. Můžete to ještě trochu přiblížit?
Z hlediska difuze se amyloid chová podobně jako jiné makromolekuly, jejichž deposice je v CNS běžná, viz molekuly extracellulární matrix. V jiné naší práci jsme nedávno ukázali, že nadměrná produkce matrix vede k rozšíření ECP. Příkladem jsou třeba gliomy. Takové rozšíření pak např. vede k usnadnění migrace nádorových buněk, ale mohlo by být využito i k lepšímu a cílenému průniku některých látech pro jejich léčbu. Naopak myši, u nichž byla zablokována produkce těchto makromolekul (tenascinů), měly ECP abnormalně malý a zvířata byla náchylnější k poškození cytotoxickými látkami. Dovedu si představit štěpení nežádoucích makromolekul enzymy a jinými látkami. Takové studie se provádějí např. u nádorů nebo u míšního poranění, kde deposice chondroitinsulfát proteoglycanů brání regeneraci axonů.
 
Je obtížné najít zvíře, které je vhodným modelem pro tuto lidskou nemoc? V čem je podobná a v čem se liší choroba u testovaných myší?
Všechny zvířecí modely jsou nedokonalé a proto, pokud chceme cenné výsledky pokusů na zvířatech uplatnit v medicíně, nezbývá než provádět opatrné, ale dostetečně rozsáhlé klinické zkoušky. Po provedení preklinických zkoušek na zvířatech tak často dojde během klinické studie k překvapení v positivním i v negativním smyslu. Na jejich základě pak také zjistíme, jak dokonalé naše modely byly.
 
Děkuji vám za rozhovor.
MUDr. Michal Pelíšek