Fotografie: Matouš Vokatý (2. LF)
Postavili jsme další molekuly na startovní čáru diagnostického využití, říká dr. Daniela Kužílková
Postavili jsme další molekuly na startovní čáru diagnostického využití, říká dr. Daniela Kužílková
Pro diagnostiku leukémií ze vzorků kostní dřeně jsou klíčové monoklonální protilátky – proteinové molekuly, které se dokážou navázat na určité povrchové antigeny leukemických buněk. Díky fluorescenčnímu značení je pak lze „rozsvítit“ a identifikovat v průtokovém cytometru – například určit typ leukémie. O tom, jak tyto chytré protilátky přicházejí na svět, jsme mluvili s cytometristkou dr. Danielou Kužílkovou, první autorkou článku, který představuje rovnou dvacet pět nových validovaných klonů. Věděli jste, že při cytometrické diagnostice pomáhá i cit pro estetiku vzorců?
Kdo všechno tvoří komunitu cytometristů a jak široká tato oblast vlastně je?
Cytometrická komunita je široká a pestrá, hematologie a imunologie tvoří jen její malou část. Cytometrickou analýzu buněk využívají také třeba rostlinní biologové, zoologové nebo farmaceuti. Pojí nás technologie – vedle masivních přístrojů, které potřebují pevnou podlahu, existují i „kapesní“ přístroje, včetně například přenosných cytometříčků, které na lodích používají mořští biologové
Přes jaké obory jste si k cytometrii našla cestu?
Vystudovala jsem biochemii. Biochemici zkoumají jednotlivé proteiny a jejich interakce, jdou do hloubky, jenže mi to nepřišlo moc zábavné. Fascinovalo mě, jak to funguje na úrovni buněk, a vždycky mě zajímala hematologie. Když v CLIPu nabírali diplomanta, neváhala jsem – hematologie, navíc dětská, to bude báječně zajímavé! Od proteinů jsem se postupně propracovala k imunologii a hematologii – vše pomocí průtokové cytometrie. Standardní cesta k nám do CLIPu vede z Přírodovědecké fakulty spíš přes imunologii.
bio
Mgr. Daniela Kužílková, Ph.D., je odborná pracovnice v oblasti průtokové cytometrie, působí na Klinice dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FNMH ve skupině CLIP. Zabývá se zejména buněčnou signalizací, validací monoklonálních protilátek a vývojovými aspekty imunitních a leukemických buněk. Je též školitelka kurzů průtokové cytometrie.
Že jde skutečně o jogurt, je výsledek práce potravinářské inspekce, která kontroluje výrobce. A podobně to funguje i u monoklonálních protilátek.
V cytometrii jsou klíčové monoklonální protilátky, pomocí kterých dokážete identifikovat leukemické buňky. Už od počátku osmdesátých let se validují čili ověřují na workshopech, z nichž jeden jste právě pořádali. Proč je třeba monoklonální látky validovat, když už vlastně existují?
Představte si, že jdete do obchodu a koupíte si kelímek, na kterém je napsáno „jogurt“. Automaticky předpokládáte, že to je jogurt, není to ale samo sebou – to, že jde skutečně o jogurt, je výsledek práce potravinářské inspekce, která kontroluje výrobce.
A podobně to funguje i u monoklonálních protilátek. V osmdesátých letech ve vědeckém světě žádný validátor nebyl. Akademici, kteří protilátky vyvíjeli, si chtěli být jistí, že právě tato reagencie rozpoznává tuto buněčnou strukturu a je použitelná při této nemocí. Dnes jsou to komerční výrobci, kteří potřebují získat externí validaci svých reagencií, aby bylo možné získat stejné molekuly se stejným označením proti stejnému cíli od různých výrobců. Proto se ustanovila tato spolupráce v podobě workshopů.
To znamená, že jsou k dostání i nevalidované protilátky, které nefungují?
Ano, to se bohužel dostává. Proto solidní výrobci chtějí, aby jejich protilátky prošly workshopem a dostaly certifikaci v podobě studie nebo seznamu zveřejněném panelem konsorcia.
Jakým způsobem se vzorky monoklonálních látek validují?
Nejprve testujeme, zda jsou nové protilátky reaktivní – tedy zda dokážou zobrazit fyziologickou přítomnost daného znaku na buňkách periferní krve. Vyzkoušíme několik dárců a hledáme stabilní pattern čili vzorec ukazující, že reaktivita je stále stejná. Pokud se mezi dárci liší, musíme rozdíly na základě literatury vysvětlit. K pojmenování nové molekuly ale nestačí jediný klon, je potřeba mít alespoň dvě nezávislé monoklonální protilátky, které dávají shodný výsledek – teprve to vylučuje náhodu nebo nespecifickou vazbu.
Druhý krok je ještě důležitější. Vezmeme buňky, které daný znak normálně neexprimují, a geneticky je upravíme tak, aby na svém povrchu nesly právě ten jediný protein, který chceme identifikovat. Tyto buňky následně označíme protilátkou, s níž ve workshopu pracujeme, a sledujeme, zda reaguje, nebo ne. Pokud se protilátka nedokáže navázat na buňky, které tento protein uměle exprimují, není specifická a validací neprojde.
Jak validace probíhá u leukemických buněk? Musíte mít vzorek od člověka, který má daný podtyp nemoci?
Znaky, které se vyskytují na leukemických buňkách, nejsou úplně nové molekuly – patří jenom do jiného stádia vývoje buňky. Představte si vývoj dítěte: od holého miminka až po vousatého starce. Podobně se vyvíjejí krevní buňky. Leukemické buňky to ale rády dělají tak, že na svém povrchu najednou vystaví nezvyklé proteiny – jako kdyby miminku najednou vyrostly šedivé vousy. Proto nemusíme čekat na konkrétní typ leukémie, ale validujeme protilátky na normálních, zdravých buňkách. Pokud protilátka správně rozpoznává fyziologické vzorce exprese, ověřujeme její chování i na patologických buňkách.
Pomůže vám dvacet pět monoklonálních protilátek, které jste validovali, také při diagnostikování leukémií?
Dvě z nich jsou vhodní kandidáti. Kromě toho jsme dokončili validaci dalších dvou znaků z předchozího workshopu. Jedním z nich byl znak CCR9, ke kterému už existuje schválená klinická studie pro rezistentní akutní lymfoblastickou leukémii. To je velmi důležité pro pacienty, pro které byly vyčerpány všechny terapeutické možnosti. Tuto protilátku bychom co nejdříve chtěli zařadit do praxe.
A ty zbylé molekuly?
Pro ně nyní terapeutické využití nemáme. Postavili jsme je na startovní čáru – spousta molekul dosáhne své slávy až dlouho po validaci. Jakmile se zjistí, že u nějakých nádorových buněk, a to nejen z hematologického světa, ale třeba u nádoru pankreatu, jde o zajímavý povrchový znak, mohou naplnit svůj potenciál.
V čem spočívá výhoda průtokové cytometrie oproti genetické diagnostice?
Například jsme schopni zjistit, zda-li se terapeuticky cílitelná molekula opravdu nachází na povrchu buňky. Genetik si o lokalizaci molekul může nechat jenom zdát, protože to není schopný změřit. Změří expresi na genetické úrovni, ale neví, jestli se daný protein skutečně vytvoří a dostane se na povrch buňky, aby mohl být rozpoznán a mohlo se na něj cílit. Síla průtokové cytometrie spočívá v tom, že ukáže, zda se cílitelný protein skutečně nachází tam, kde ho jsme schopni léčebně zasáhnout.
Síla průtokové cytometrie spočívá v tom, že ukáže, zda se cílitelný protein skutečně nachází tam, kde ho jsme schopni léčebně zasáhnout.
Kterou část této práce je dobré dělat ráno se svěží myslí?
Pro mě je to hledání takzvaných zbytkových leukemických buněk a jejich skupin. Tady se zase projevuje nevýhoda cytometrie, a sice že je snadno zatížitelná technickými artefakty. Ve vzorku kostní dřeně vám plave cucek, v protilátce je sraženina... Jenže stroj ji změří jako něco odlišného od ostatních buněk. Když v pátek odpoledne nebudete pozorní, řeknete si, to je báječné, tato buňka je divná, to je ta leukemická! Ale chyba lávky. Kolikrát také odcházím s tím, že jsem ve vzorku nic neviděla, ale radši se podívám ještě ráno s čerstvou hlavou.
Je to práce nesmírně náročná na oči. Vidíte promítnuté jednotlivé průlety buněk laserovým paprskem cytometru, přepínáte zobrazení podobně jako mezi turistickou nebo leteckou mapou a hledáte vzorce. Když nejste zvyklý, bolí vás z míhajících se červených a modrých teček oči. Když jsem začala dělat diagnostiku, manžel se podivoval, proč večer sedím se zavřenýma očima. Viděla jsem všude samé tečky a nemohla se toho zbavit.
Jak dlouho trvá, než se do toho člověk dostane?
Cytometrie je náročná na osobní zkušenost, a my konkrétně se pohybujeme v poli vzácných onemocnění. Jednodušší úlohy zvládnete za několik měsíců, na složitější to chce aspoň rok. Podobně jako při řízení auta je člověk na začátku náchylnější k chybám, protože má pocit, že už tomu rozumí, ačkoliv s mnoha situacemi se stále nesetkal. Jak říkají morfologové: „Co jsem v životě neviděl, to nejsem schopný posoudit.“
Proto je před vydáním klinického výsledku potřeba, abychom si data vzájemně ukázali a udělali si druhé oči. V kanceláři nás sedí šest a rádi svoje zkušenosti sdílíme. Dětských leukémií je sto ročně, a když se jednou za dva roky objeví nějaká hodně zvláštní, potřebujeme opravdu hodně lidí, aby se na to v klidu podívali, vyspali se a podívali znova.
Pokud se někomu ty obrazce nelíbí, necítí, když data „ladí“, k cytometrii nepronikne.
Co je pro vás satisfakce?
Když mám data, která dávají smysl, a všechno dobře dopadne. V cytometrii je nesmírně důležitý i vizuální dojem – mně se ta data prostě líbí! Baví mě dívat se na ně v barvách, proklikávat jednotlivé grafy a říkat si: ano, tady to je, tady to vidím. Je to spousta malých satisfakcí. A nakonec je to trochu jako u zahrádkáře, kterému vykvete kytka.
V estetice se zkoumá role citu a intuice ve vědě, mluví se třeba o kráse Einsteinových rovnic. Musejí mít cytometristé estetický cit?
Cytometrie je bytostně estetická záležitost! U leukemických buněk vznikají vizuálně překvapivé jevy, tečky tvoří různé hezké obrazce: ráčka, velrybu... Někdy to připomíná pointilismus a cytometristé si je rádi posílají. Nejednou krása souvisí se zdravím: díváte se na shluk teček a říkáte si, tak takovouhle kostní dřeň bych rozhodně mít nechtěl. Některé leukémie navíc v průběhu léčby takzvaně switchují, mění svůj vizuální vzorec... Genetici to neocení, protože pracují hlavně s křivkami. V tomhle to cytometristé mají bohatší a zábavnější.
Bez estetického citu by to ani nešlo. Jedna část práce je technická – nastavení a kalibrace přístroje –, druhá spočívá v samotném pohledu na data. Pokud se někomu ty obrazce nelíbí, necítí, když data „ladí“, nebude tu práci dělat dobře, vlastně k cytometrii nepronikne. Takže u nás sedí lidé, kteří to opravdu mají rádi a líbí se jim to.
